本文来源：类器官学社

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《2024年度国家自然科学基金项目指南》发布在即，预示着新一年的国自然申请将到来，想必很多申请人已经苦思冥想写出了一份自己的国自然标书初稿。

想要专家一眼“相中”你的本子，除了选题新颖、导向明确、思路清晰等条件外，高大上且能够快速完成的前期数据也能助拿下国自然一臂之力。这时，近年来国自然研究热点的“黑马”——类器官，就是个不错的选择！

正所谓“万变不离其宗”，开展类器官的研究，咱们可以这样去套用：

构建类器官；进行转录组及蛋白质组学检测；药物敏感性检测；筛选出可预测药物治疗效果的标志物。

今天小学社就以上半年刚发表的7分研究为例，介绍“类器官+组学鉴定+药敏检测”的做法，希望能为大家申报2024年国自然打开新思路！

#1

研究背景

Background

人类肿瘤细胞的分子异质性使胃癌治疗变得复杂，这限制了标准治疗的疗效，并且需要个性化治疗的开发。 患者来源的类器官（PDO）是一种很有前途的临床前癌症模型，在预测药物敏感性方面表现出较高的临床疗效，从而为个性化精准医疗提供了新的手段。

#2

研究思路

Methods

1. 临床问题：胃癌的高发率和高死亡率、传统化疗方案的局限性、胃癌的分子异质性和个体差异性等，制约了胃癌治疗的效果和个性化治疗的发展；

2. 构建类器官：培养患者来源类器官模型（PDO）

3. 类器官鉴定：经组织学鉴定，证明PDO与原始组织具有相似的组织学形态；再通过基因水平鉴定，表明转录组学检测PDO与原始组织基因表达相似。

4. 药敏检测：检测PDO对临床治疗药物的敏感性；

5. 治疗效果保真度验证：对比患者临床治疗效果，证明PDO对药物的反应性与原患者高度一致；

图形概要

#3

研究内容

Research

1.构建PDO

A. 获得组织：组织类型主要是三种：正常组织、肿瘤组织和活检组织。

B. 处理样本：剔除非上皮组织（脂肪和肌肉组织）后，进行消化解离。

C. 加入培养基：接种到3D基质胶中，加入含有生长因子的培养基。

D. 观察形成的PDO

E. 进行传代和药敏试验

点击回顾：

一文打尽：如何培养PDO？

《人胃肠上皮组织类器官的构建与保藏操作指南》

类器官培养中的常见问题及解答

看完以上三篇文章，相信各位都能对类器官培养有一定的了解。

2.类器官组织学鉴定

研究团队收集患者源组织样本，并根据上述方法培养PDO，通过HE以及IHC染色等方法对原始组织和PDO的形态、抗原表达进行了鉴定，发现类器官于原组织具有相似的抗原表达和形态结构）。

图 1. PDO 的建立和组织学特征。A，从患者肿瘤中建立 PDO 的流程图，以便随后进行培养和药敏试验。B, 12 个 PDO 的明视野图像。比例尺：100 µm。C、原发肿瘤和 PDO（患者 3、5、6、9、10 和 11）的代表性 H&E 染色。比例尺：100 µm。D、原发性肿瘤和患者 3 的 PDO 的 CgA 以及原发性肿瘤和患者 12 的 PDO 的 CDX2 的 IHC 染色。比例尺：100 µm

3.类器官基因组学鉴定

研究人员对相应的PDO和原始组织样本进行了WES分析，包括体细胞变异检测、突变特异性分析和显着突变基因分析。结果显示PDO与原始组织的单核苷酸多态性 (SNP)在编码序列 (CDS) 区域显示出 95.39% 的共同 SNP。此外，将PDO与相应组织样本中的这些基因进行比较后发现，这些突变也是保守的，这表明PDO高度代表了胃癌的整体情况。

图 2. 胃癌 PDO 的基因组图谱。A, PDO12 和 T12 的圆环图，显示 CNVs。第一环：染色体信息（数字代表染色体号、相应染色体长度和核型）；第二环：测序覆盖图（蓝色，每 0.5 Mbp 为一个单位，计算其平均覆盖率）；第三环：密度（绿点，每 1 Mbp 为一个单位）。B，PDO12 和 T12 CDS 区域的 SNP 共同突变。2InCommon，两个样本中共同突变的数量。C，PDO12 和 T12 CDS 区域各自的 SNP 突变。方框的颜色表示检测到的突变类型：停止丢失（中蓝色）、移帧插入（浅蓝色）、未知（绿色）、非移帧插入（黄色）、移帧缺失（紫色）、停止增益（粉红色）、非移帧缺失（深蓝色）。D，高频突变热图。上栏图，每个样本的突变/Mb；下栏热图，高频突变基因和突变类型（腹坐标为样本名称，纵坐标为高频突变基因）；图中不同颜色代表不同的突变类型：错义（红色）、框移（绿色）；热图左边的柱状图表示每个基因发生突变的样本比例。

Tips：对类器官来说，建议还是要加入二代测序对其基因组进行一致性鉴定，证明其遗传保真度。

4.药物敏感性检测与临床回顾性分析

研究人员将PDO暴露于不同的化疗药物或靶向药物，以评估其对药物的反应。他们使用ATP生物发光法来测量PDO的细胞存活率，并计算IC50值，以确定药物的有效剂量。此外，研究人员还将PDO的药物敏感性与患者的临床结果进行比较，以评估PDO作为预测性药物敏感性测试的可行性和潜在价值。

图 3. PDO 对药物治疗的敏感性。A，PDO 对 21 种药物治疗的敏感性热图。颜色代表药物反应，根据 AUC 评估：敏感（紫色）、中等（橙色）、耐药（绿色）、不适用（灰色）。左侧列出了测试药物。上图显示的是类器官线。B、明视场显微镜图像，显示 5-FU 敏感型（PDO12）、5-FU 中效型（PDO10）和 5-FU 耐药型（PDO6）类器官在处理 72 小时后的形态差异。红色箭头所示为结构破坏的类器官。比例尺： 100 微米。5-FU（18 μM）。

结果发现，PDO的药物敏感性测试结果与患者的临床反应高度相关，表明PDO可以作为预测性药物敏感性测试的有效工具。此外，研究人员还发现，PDO的药物敏感性测试结果可以帮助指导患者的临床治疗方案，从而实现个体化的精准医疗。

图 4. PDO1 对患者 1 临床结果的预测。A、PDO1 的 AUC 值和 10 种药物反应的顺序。每种检测方法对每个类器官株都进行了一式三份的检测。B、患者 1 从手术到辅助用药的治疗过程。红色字母代表药物治疗方案；灰色箭头表示时间点检查。C、消化道超声波检查显示，患者 1 在术后 5 个月或 10 个月没有复发或转移。D、CT 扫描图像显示肿瘤确诊时的情况，1 号患者术后 6 个月无复发或转移。红色箭头表示肿瘤。E、肿瘤标记物折线图。横轴代表时间，纵轴代表数值，颜色代表肿瘤标志物，CA19-9 为绿色，CA125 为红色，CEA 为蓝色。

图 5. PDO5 对患者 5 临床结果的预测。A、PDO5 中 5-FU 反应的 AUC 值和顺序。每种检测方法对每个类器官株都进行了一式三份的检测。B、患者 5 从手术到辅助用药的治疗过程。红色字母代表用药方案；灰色箭头表示时间点检查。C、CT 扫描图像显示了患者 5 诊断时的肿瘤情况以及术后 1、2 和 4 个月时的腹部情况。红色箭头表示肿瘤。D、上消化道系列显示诊断时的肿瘤情况和患者 5 术后 1 个月时的腹部情况。红色箭头表示肿瘤。E、患者 5 的癌胚抗原（CEA）折线图。横轴代表时间，纵轴代表数值。F、PDO 反应数据与患者的临床结果相符。实线表示匹配，虚线表示不匹配。

Tips：检测药物敏感性后，大多要根据临床的影像学结果及病理学结果对患者治疗效果做出金标准的诊断，并以类器官预测效果作为诊断指标做ROC分析，确保类器官具有相似的药物反应性。

这样一整个“标准套路”，轻松拿下7分杂志。如若还想往上冲一冲，还可以考虑在上述研究后再加一步：通过转录及蛋白组学识别影响药物敏感性的关键基因和蛋白。

Tips：根据药敏结果，对不同敏感性的类器官进行组学检测，明确其根本性改变，并据此筛选出靶点。

#4

国自然申请

NSFC

那在国自然申请中，我们需要怎么做呢？

1. 关注临床问题，比如说xx肿瘤对于xx耐药；

2. 收集临床样本构建类器官，进行鉴定；

3. 药物敏感性检测，区分敏感型和耐药型，并对二者进行组学检测；

4. 根据组学结果筛选出靶点，在样本中进行验证。

以上数据为前期结果数据，以下为后期规划：

5. 对靶点进行基因编辑，再于类器官中进行验证；

6. 通过寻找互作蛋白或者寻找下游通路对该靶点的机制进行阐述；

7. 通过基因敲除鼠对该靶点进行进一步的验证；

8. 转化意义：诊断（通过该靶点进行药物敏感性预测）/治疗（针对该靶点开发靶向策略）。

综上所述，我们可以利用类器官这种新兴技术及组学技术，将前期数据做得高大上，令人眼前一亮。另外，类器官作为眼下热门的兴新技术之一，本身就具有很高的科研价值和临床价值，所以在申请国自然中具有独到优势。

参考信息：

Zu M, Hao X, Ning J, Zhou X, Gong Y, Lang Y, Xu W, Zhang J, Ding S. Patient-derived organoid culture of gastric cancer for disease modeling and drug sensitivity testing. Biomed Pharmacother. 2023 Jul;163:114751. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114751IF: 7.5 Q1 . Epub 2023 Apr 26. PMID: 37105073IF: 7.5 Q1 B2.

本文来源：类器官学社

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